Primer adalah fragmen kecil dari DNA beruntai tunggal yang dirancang untuk mengikat secara khusus ke satu wilayah dalam genom untuk memungkinkan amplifikasi yang tepat dari area target diagnostik. Probe mengikat ke area target dan mengeluarkan sinyal fluorescent sebagai tanda bahwa terjadi peningkatan amplifikasi pada area tersebut. Sinyal fluorescent ini kemudian dibaca oleh mesin RT-PCR kuantitatif dimana reaksi terjadi untuk memberikan pembacaan diagnostik. Ilmuan Molekuler menggunakan banyak tools berbeda untuk merancang primer yang paling tepat untuk menciptakan target diagnostik yang fungsional.

Primer
Primer adalah fragmen DNA atau RNA pendek yang berfungsi sebagai inisiator untuk sintesis DNA. Enzim DNA polimerase menambahkan nukleotida ke kelompok OH 3 ‘dari urutan primer dan mensintesis untai baru yang melengkapi DNA cetakan. Primer adalah fragmen yang sangat pendek dengan panjang 18 hingga 20 nukleotida. Mereka disintesis secara kimiawi di laboratorium untuk amplifikasi DNA in vitro (PCR). Primer dapat memiliki urutan nukleotida apa pun karena dirancang oleh pengguna. Mereka disintesis untuk dicocokkan dengan basa komplementer dari DNA cetakan. Oleh karena itu, ia dapat memiliki urutan nukleotida apa pun. Primer sangat penting untuk replikasi DNA karena DNA polimerase tidak dapat mensintesis DNA baru tanpa potongan DNA yang sudah ada sebelumnya. Saat merancang primer untuk PCR, hal-hal berikut perlu dipertimbangkan:

• Primer harus mengandung nukleotida komplementer ke ujung mengapit DNA yang ingin diamplifikasi.
• Primer harus memiliki melting temperature antara 55 – 65°C
• Annealing temperature berada 5°C dibawah melting temperature masing-masing primer
• Komposisi basa G dan C berada antara 35%-60%, dengan komposisi ideal 50%

Dalam PCR digunakan dua primer yaitu primer forward dan primer reverse untuk mereplikasi kedua untai DNA sampel.

Sumber: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Polymerase_chain_reaction.svg?

Probe
Probe adalah fragmen DNA atau RNA yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan fragmen DNA tertentu di dalam sampel. Oleh karena itu, probe dapat digunakan untuk dua jenis teknik, dalam qPCR dan dalam reaksi hibridisasi. Empat hal yang harus dipertimbangkan dalam merancang probe adalah:

• Lokasi: Idealnya, probe harus berada di dekat primer maju atau mundur, tetapi tidak boleh tumpang tindih dengan tempat pengikatan primer pada untai yang sama. Probe dapat dirancang untuk mengikat kedua untai target.
• Melting Temperature (Tm): Lebih disukai, probe harus memiliki Tm 6–8°C lebih tinggi daripada primer. Jika Tm terlalu rendah, persentase pengikatan probe dengan target akan rendah. Dalam hal ini, primer dapat mengamplifikasi produk, tetapi sensitivitas probe yang rendah mengakibatkan berkurangnya sinyal fluoresensi sehingga tidak benar-benar mewakili jumlah sebenarnya dari target yang ada dalam sampel.
• Suhu Annealing (Ta): Suhu anil harus diatur tidak lebih dari 5°C di bawah Tm primer yang lebih rendah. Gunakan ini sebagai pedoman umum, tetapi perhatikan bahwa pengoptimalan mungkin masih diperlukan.
• Komposisi basa GC: Seperti urutan primer, arahkan untuk konten GC 35−65% dan hindari G di ujung 5 ‘untuk mencegah quenching dari fluorofor 5’.

Probe dan primer adalah dua jenis oligonukleotida beruntai tunggal yang digunakan dalam berbagai jenis PCR. Probe digunakan untuk mendeteksi fragmen DNA spesifik di qPCR. Primer digunakan untuk memulai replikasi DNA di dalam sel dan juga digunakan dalam inisiasi PCR. Oleh karena itu, perbedaan utama antara probe dan primer adalah tujuannya.

Referensi:
Difference Between Probe and Primer, https://pediaa.com/difference-between-probe-and-primer/
Designing PCR primers and probes, Integrated DNA Technologies