ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) adalah teknik pengujian berbasis plate yang dirancang untuk mendeteksi dan mengukur peptida, protein, antibodi, dan hormon. Dalam ELISA, antigen harus diimobilisasi ke permukaan padat dan kemudian dikomplekskan dengan antibodi yang terkait dengan enzim. Proses deteksi dilakukan dengan melihat perubahan warna akibat aktivitas enzim terhadap substrat. Elemen terpenting dari strategi deteksi adalah interaksi antibodi-antigen yang sangat spesifik.

Prosedur pemeriksaan ELISA diawali dengan proses penempelan (coating) antigen dan/atau antibodi pada permukaan sumuran pada plate. Selanjutnya dilakukan tahap blocking (penghalangan) ikatan antigen dan antibodi pada unspecific-site dengan agen pemblokiran. Setelah inkubasi dan pencucian, plate diinkubasi dengan antibodi yang terikat enzim. Selanjutnya dilakukan pencucian plate dan dilanjutkan dengan penambahan substrat sehingga dihasilkan perubahan warna dan dibaca nilai OD (optical density) dengan ELISA reader. Substrat ini berubah warna saat bereaksi dengan enzim.

Tahap pencucian merupakan tahapan yang penting untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat dengan antigen. Selain itu, pastikan tidak ada cairan pencuci yang tertinggal di plate, karena dikhawatirkan akan mempengaruhi tahap pemeriksaan selanjutnya.

Sumber: European Union Reference Laboratory

Jenis ELISA

ELISA dapat dilakukan dengan sejumlah modifikasi pada prosedur dasar: langsung, tidak langsung, sandwich atau kompetitif. Langkah kuncinya, imobilisasi antigen yang diinginkan, dapat dilakukan dengan adsorpsi langsung ke plate uji atau secara tidak langsung melalui antibodi penangkap yang telah dilekatkan pada plate.

Sumber: BOSTER, ELISA Handbook

Direct ELISA. Merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan  mengukur konsentrasi antigen pada sampel. Antigen yang akan dideteksi akan berikatan langsung (direct) dengan antibodi detector (antibody yang telah dilabeli oleh enzim).

Kelebihan:

• Cepat karena hanya menggunakan satu antibodi
• Tidak adanya cross-activity dengan antibodi sekunder

Kekurangan:

• Imunoreaktivitas antibodi mungkin akan terpengaruh oleh enzim
• Sinyal yang dihasilkan lemah
• Membutuhkan waktu yang lama untuk pewarnaan setiap jenis antibodi

Indirect ELISA, Untuk deteksi tidak langsung, antigen yang diimobilisasi ke well plate dideteksi dalam dua tahap atau lapisan. Pertama, antibodi primer yang tidak berlabel menempel pada antigen spesifik. Selanjutnya, antibodi sekunder terkonjugasi enzim terikat pada antibodi pertama.

Kelebihan:

• Sensitivitas tes meningkat dengan penggunaan antibodi primer dan sekunder.

Kekurangan:

• Reaksi silang dapat terjadi dengan antibodi sekunder yang akan menghasilkan sinyal yang tidak spesifik.
• Diperlukan waktu inkubasi yang lebih lama
• Biaya yang diperlukan lebih besar daripada metode langsung

Sandwich ELISA, Pemeriksaan ELISA ini membutuhkan dua spesifik antibodi untuk epitop berbeda dari antigen. Kedua antibodi biasanya disebut sebagai pasangan antibodi yang cocok.

Kelebihan:

• Memiliki spesifisitas tinggi
• Cocok digunakan dengan sampel yang kompleks (tidak murni)

Kekurangan:

• Biaya cukup besar karena menggunakan dua antibodi

Competitive ELISA, Metode dimana terjadi reaksi kompetitif antara antigen sampel dan ikatan antigen yang melekat pada bagian bawah well plate dengan antibodi primer. Dalam metode ini, antigen non-sampel dilekatkan pada bagian bawah plate. Selanjutnya sampel antigen dan antibodi primer dimasukkan ke dalam well. Kemudian dimasukkan antibodi sekunder yang terikat pada enzim di dalam sumur di atas plate. Kedua antibodi tersebut akan berkompetisi untuk berikatan dengan antigen.

Kelebihan:

• Tingkat sensitivitas yang tinggi

Interpretasi Data ELISA

Uji ELISA menghasilkan tiga jenis output data yang berbeda:

1. Kuantitatif, Data ELISA dapat diinterpretasikan dengan cara dibandingkan dengan kurva standar (pengenceran serial dari antigen yang diketahui dan dimurnikan) untuk menghitung secara tepat konsentrasi antigen dalam berbagai sampel.
2. Kualitatif , ELISA juga dapat digunakan untuk menghasilkan jawaban ya atau tidak yang menunjukkan apakah antigen tertentu ada dalam sampel, dibandingkan dengan sumur kosong yang tidak mengandung antigen atau antigen kontrol yang tidak terkait.
3. Semi-Kuantitatif, ELISA dapat digunakan untuk membandingkan tingkat relatif antigen dalam sampel pengujian, karena intensitas sinyal akan bervariasi secara langsung dengan konsentrasi antigen.

Referensi:
BOSTER, Antibody and ELISA Expert. ELISA Handbook.

Hidayat, R., & Patricia Wulandari. (2021). Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Technique Guideline. Bioscientia Medicina : Journal of Biomedicine and Translational Research, 5(5), 447-453.